亨廷顿病（Huntington's disease, HD）作为一种常染色体显性遗传性的神经退行性疾病，其主要病因是位于人类四号染色体上的huntingtin基因中1号外显子内的胞嘧啶-腺嘌呤-鸟嘌呤（cytosine-adenine-guanine, CAG）三核苷酸重复序列发生异常延伸并导致由其转录和翻译的蛋白质发生突变而致病。然而CAG重复序列增长的机制并不清楚。TDP-43（TAR DNA-binding protein 43）是与包括肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS），额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration, FTLD）等在内的多种神经退行性疾病发生相关的致病蛋白。正常情况下TDP-43在神经细胞核中分布，参与基因转录抑制、RNA前体剪接等重要过程。当TDP-43基因发生异常突变时及在一些病理状况中，胞核中TDP-43会转移到胞浆中，造成神经细胞毒性。有研究报道在HD患者和动物模型纹状体中存在TDP-43蛋白的定位异常。同时，在ALS和FTLD患者中亦发现了HD基因中CAG重复序列的致病性扩增。但TDP-43蛋白是否影响HD动物模型中CAG重复序列尚未有研究报道。
2023年6月12日，暨南大学粤港澳中枢神经再生研究院的李晓江团队在《神经科学进展》（Progress in Neurobiology 中科院一区，影响因子10.885）杂志发表了题为“Loss of TDP-43 promotes somatic CAG repeat expansion in Huntington’s disease knock-in mice”的研究论文。研究发现在HD 基因敲入（KI）小鼠中，TDP-43的细胞核丢失影响到了DNA错配修复系统，通过异常调控周期蛋白MLH1和MSH3，促进HD KI小鼠体细胞中CAG重复序列不稳定性的增加。由此证明，TDP-43蛋白的功能异常对三核苷酸重复异常所导致的神经退行性疾病进程具有促进作用。暨南大学的白大章博士及朱龙洪硕士为文章的共同第一作者，李晓江教授和殷鹏研究员为文章的共同通讯作者。
在本文中，作者使用的HD KI（Huntington’s disease knock-in, HD KI）小鼠是将140个CAG重复的患者HD致病基因1号外显子替换了小鼠原HD基因中的对应序列，而构建的一种常用HD小鼠模型，因其致病基因在表达水平上更贴近于HD患者实际情况而被广泛使用。为了探寻小鼠内源性TDP-43的胞核缺失对HD KI小鼠纹状体组织中CAG重复序列稳定性的影响，作者利用CRISPR/Cas9基因编辑系统针对该模型小鼠的内源TDP-43基因进行敲除，并同时分析了外源插入的HD基因CAG重复序列片段（图1 A）。通过对TDP-43蛋白敲低后的人源140GAG重复序列进行PCR电泳检测（图1 B）及第三代高通量PCR扩增子测序（图1 C），作者发现在敲低内源性TDP-43蛋白的HD KI小鼠纹状体组织中，HD基因中CAG重复序列的不稳定性明显增加。
图1 敲低HDKI模型小鼠内源性TDP-43促进其纹状体组织中CAG重复序列的不稳定性增加。
接下来，为了探索敲低内源性TDP-43蛋白对促进CAG体细胞不稳定性增强的分子机制，作者对实验小鼠的纹状体组织进行了转录本测序，并对测序结果进行了差异基因的表达分析（图2 A）。通过GO功能富集（图2 B）和重点相关生物学功能的KEGG聚类等生物信息学分析（图2 C-D），作者发现MLH1和MSH3可能是影响CAG体细胞不稳定性的潜在作用分子，表现为在内源性TDP-43蛋白敲降后，MLH1和MSH3基因均发生明显的转录水平上调。
图2 敲低内源性TDP-43将促进DNA错配修复系统蛋白MLH1和MSH3的表达。
为验证内源性TDP-43蛋白敲降所导致的MLH1和MSH3高表达是造成CAG重复序列不稳定性的增加的关键蛋白，作者又针对小鼠内源性MLH1和MSH3基因设计了CRISPR/Cas9基因编辑的引导gRNA（图3 A），在HD模型小鼠纹状体中直接敲低MLH1或MSH3的基因表达，来观察其对CAG重复序列不稳定性的影响。PCR电泳检测（图3 B）及第三代高通量PCR扩增子测序（图3C）的实验结果表明敲低MLH1和MSH3的内源性表达明显降低HD小鼠纹状体组织中的CAG重复序列的不稳定性。
图3 TDP-43通过抑制DNA错配修复系统蛋白MLH1和MSH3的表达来维持CAG重复序列的稳定性。
因此，本文针对TDP-43蛋白的病理特征，对TDP-43参与HD的重要作用进行了创新性分析，通过研究TDP-43对HD基因CAG重复序列不稳定性的影响，将TDP-43蛋白的病理与HD进行了关联，不仅解释了已发现的HD患者脑中TDP-43蛋白定位异常的病理现象，也揭示了ALS和FTLD患者中HD基因中CAG重复序列扩增的分子机制。至少15种神经系统疾病与三核苷酸CAG重复序列的异常扩增有关，包括脊髓小脑共济失调(spinocerebellar ataxias, SCAs)，脊髓延髓肌萎缩症(spinobulbar muscular atrophy, SBMA)和齿状核红核苍白球路体萎缩症(Dentatorubropallidoluysian atrophy, DRPLA)等。在这些疾病中，致病基因内CAG重复序列的异常扩增导致相应编码蛋白突变是造成疾病发生的主要原因。由于这些疾病与HD同属CAG重复序列疾病，本文的发现对其他神经退行疾病中CAG重复序列增长的分子病理机制研究，也有重大指导意义。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.pneurobio.2023.102484
